PROGETTO DNA FINGERPRINTING E ESTRAZIONE DEL DNA

 

Nell’a.s. 2004/05 i giorni 16 e 17 maggio 2005 le classi 3^A Scienze Sociali e 2^B Linguistico hanno preso parte all’attività di ricerca del dna fingerprinting e estrazione del dna dalla banana, presso il nostro laboratorio insieme all’Associazione Life Learning Center di Bologna.

Il progetto è stato svolto da tecnici del LIFE LEARNING CENTER di Bologna dal Tecnico di laboratorio del liceo Spadazzi Federica dai Docenti di scienze del Liceo Prof. Dellavalle Massimo e Prof. Focacci Paola.

 

I protocolli svolti sono stati i seguenti:

                                                       

estrazione del dna                                                                              dna fingerprinting

                        

 

ciccare sulle icone per visualizzare i protocolli

 

 

Alcuni momenti delle classi durante l’attività

 

                                                                                                                                                                                                                              

 

 

                                              

 

 

 

                             

 

 

 

                                                            

               

 

                                                                             

 

 

 

                                                            

 

 

 

                          

 

 

 

                             

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

ESTRAZIONE DEL DNA DA CAMPIONI VEGETALI

 

 

OBIETTIVO

 

Osservare il DNA, che estratto in grandi quantità da cellule vegetali, diventa visibile ad occhio nudo.

 

INTRODUZIONE

 

Il DNA, o acido desossiribonucleico, è la molecola in cui sono conservati i caratteri ereditari di un organismo, le informazioni necessarie a dare luogo a tutti i suoi processi vitali. Nella cellula a riposo, si trova associato a un gran numero di proteine (l’insieme di DNA e proteine prende il nome di cromatina) all’interno del nucleo. Piccole proteine dette istoni, presenti solo nel nucleo delle cellule eucarioti, permettono al DNA di ripiegarsi e di avvolgersi ripetutamente su se stesso. Grazie alla presenza degli istoni, che si trovano organizzati in strutture più complesse dette nucleosomi, le lunghe molecole di DNA si ripiegano molte volte su se stesse, formando un grumo compatto che si trova all’interno del nucleo della cellula.

Attraverso un insieme di procedure volte a demolire il doppio strato fosfolipidico delle membrane (quella cellulare e quella nucleare), e a “liberare” gli acidi nucleici dalle proteine attorno a cui sono avvolti (tale processo è denominato digestione), sarà possibile estrarre il DNA dall’involucro cellulare e portarlo in soluzione.

La molecola del DNA è solubile in acqua, ma non, ad esempio, in etanolo. Per questo motivo, essendo la soluzione di estrazione a base acquosa, il DNA non è ancora visibile. Per poterlo rendere osservabile è necessario metterlo in un ambiente non a lui affine: l’etanolo (o alcol etilico). In etanolo il DNA forma un denso aggregato che diventa visibile ad occhio nudo.

In questa esperienza si possono usare diversi campioni biologici ma, per la facile reperibilità e la semplicità di lavorazione, si consiglia l'uso di frutta fresca, in modo particolare di quella polposa che facilmente si può ridurre in poltiglia (es. banana, kiwi, caco, pera molto matura, ecc.).

 

 

COSA FARE PRIMA DELL’ARRIVO DELLA LAB CAR

 

 

 

PROTOCOLLO

 

Materiale occorrente

 

 

Procedimento

 

Questo lavoro si può articolare in tre momenti fondamentali:

  1. Preparazione della soluzione di estrazione per demolire la struttura cellulare.
  2. Digestione delle proteine con il succo di ananas.
  3. Precipitazione del DNA con l’etanolo.

 

1        Preparazione della soluzione di estrazione per demolire la struttura cellulare.

 

·        Pesare 3 g di cloruro di sodio e metterli nel cilindro graduato da 100 ml. Il cloruro di sodio, dissociato negli ioni Na+ e Cl- agisce sugli istoni.

·        Preparare 10 ml di detergente e versarli nel cilindro con il cloruro di sodio. Il detergente agisce sulle membrane cellulari, del nucleo e della cellula stessa.

·        Aggiungere acqua distillata fino ad un volume di 100 ml. Agitare bene per sciogliere il sale.

·        Prendere circa 100 g di polpa di frutta, metterla in un becker (o bicchiere) e schiacciarla con una forchetta.

·        Versare la soluzione di estrazione nella poltiglia ottenuta.

·        Attendere almeno 5 minuti affinchè la soluzione di estrazione faccia effetto sulle cellule del frutto utilizzato.

·        Filtrare il preparato in un becker pulito con un colino.

 

2        Digestione delle proteine con il succo di ananas

 

·        Prelevare 25 ml di filtrato e porlo nella provetta da 50 ml.

·        Aggiungere 5 ml di succo di ananas e agitare bene. Nel succo di ananas è contenuta la bromelina, sostanza che demolisce le proteine, in particolare gli istoni legati al DNA. Per digestione delle proteine si intende la loro demolizione fino ad aminoacidi.

·        Attendere pochi minuti in modo che la bromelina contenuta nel succo di ananas agisca sulle proteine degradandole.

 

 

3        Precipitazione del DNA con l’etanolo

 

·        Prelevare 6 ml della soluzione ottenuta e trasferirli nella provetta da 20 ml.

·        Aggiungere un ugual volume di etanolo freddo (è sufficiente mettere l'alcool nel freezer per un'ora). Versarlo lungo il bordo della provetta con attenzione in modo da formare uno strato sulla superficie del filtrato. Il DNA che si trova a contatto con l’etanolo precipita richiamando continuamente altro DNA.

·        Sul momento si formano delle bollicine di gas, aspettare che termini il fenomeno. A questo punto è possibile osservare nell'interfaccia acqua-alcool una sostanza trasparente che va via via aumentando: è il DNA. Il DNA che prima si trovava in soluzione nell'acqua ora si trova a contatto con l'etanolo; in questo ambiente il DNA non è solubile quindi diventa ben visibile.

 

N.B. Un soluto precipita quando non riesce più a stare in soluzione, cioè a mescolarsi in modo omogeneo con le molecole del solvente: questo processo è influenzato dalla pressione, dalla temperatura e dalla natura delle sostanze a contatto.

 

OSSERVAZIONE

 

Dalla soluzione acquosa dell’estratto cellulare il DNA passa nell'etanolo, in quantità che va via via aumentando, trascinato verso l'alto da bollicine di gas disciolte nella soluzione.

All’osservazione il DNA, precipitato nell'etanolo, appare come una "medusa" trasparente ben visibile ad occhio nudo.

 

          

 

 


 DNA FINGERPRINTING

 

OBIETTIVO

Riprodurre su scala ridotta un'indagine di polizia, nella quale il materiale biologico rinvenuto sul luogo del delitto viene analizzato e comparato con quello appartenente ad alcuni sospettati, fra i quali va rintracciato il colpevole.

 

INTRODUZIONE

La tecnica del fingerprinting, consente il confronto fra genomi appartenenti ad individui diversi e per tale motivo trova applicazione in ambito medico, forense e genetico, solo per citarne alcuni.

Essendo condotta a scopo didattico, questa esperienza utilizza, quale fonte di materiale da analizzare, DNA plasmidico anziché cellule umane, al fine di snellirne e semplificarne la procedura; ciò non toglie che i passaggi proposti rispecchiano le tecniche realmente applicate.

Digestione, elettroforesi e colorazione sono i passaggi a cui viene sottoposto il DNA nella tecnica del fingerprintig:.

Per digestione s’intende il trattamento del DNA con gli enzimi di restrizione, molecole in grado di tagliare l’acido deossiribonucleico in prossimità di sequenze nucleotidiche specifiche, i frammenti prodotti saranno perciò diversi da DNA a DNA: tutti gli organismi, salvo eccezioni, possiedono una disposizione delle basi sufficientemente varia da caratterizzare l’individuo.

La tecnica elettroforetica viene utilizzata per separare i frammenti neoformati. Nelle celle elettroforetiche si genera un campo elettrico nel quale il DNA, carico negativamente, migra verso il polo positivo. La matrice (nel nostro caso agarosio), nella quale si muove il DNA, è quella che materialmente consente la separazione dei frammenti generati dalla digestione: infatti la concentrazione dell'agarosio (0,8%) conferisce al gel una porosità idonea ad ottenere la risoluzione desiderata.

Il gel dopo l'elettroforesi viene colorato per osservare i frammenti evidenziati in forma di bande.

 

 

 

  COSA FARE PRIMA DELL’ARRIVO DELLA LAB CAR

 

·        Consultare il sito www.llc.unibo.it ed aprire la voce di menù “Le Scienze della vita nella scuola dell’obbligo” dove viene riportato il Progetto Sperimentale avviato in collaborazione con cinque Istituti di Bologna e Provincia; all’interno cliccare sull’immagine relativa biotecnologie  e DNA fingerprinting

 

 

Materiale occorrente

 

 

 

Procedimento

 

Digestione enzimatica

 

 

 

OSSERVAZIONE

L'osservazione delle bande, prodotte dalla migrazione dei frammenti di DNA durante la corsa elettroforetica, permette di individuare il colpevole fra i sospettati. Il colpevole è facilmente individuabile quando il numero e la posizione delle bande del sospettato corrispondono a quelle del riferimento.